Investigați modelul de inflamație intestinală indus de DSS al IBD

rezumat

Modelele experimentale ale bolii inflamatorii intestinale ne-au permis să examinăm complexul înnăscut și adaptativ al răspunsurilor imune asociate cu patogeneza. Folosind scorul histologic, cuantificarea citokinelor pro-inflamatorii și activitatea mieloperoxidazei, se poate începe evaluarea acestor răspunsuri observate în boala inflamatorie intestinală.

Abstract

Boala inflamatorie intestinală (IBD) cuprinde o serie de patologii intestinale, dintre care cele mai frecvente sunt colita ulcerativă (UC) și boala Crohn (CD). Atât UC cât și CD, atunci când sunt prezente în colon, generează un profil de simptome similare care pot include diaree, sângerări rectale, dureri abdominale și pierderea în greutate. 1 Deși patogeneza IBD rămâne necunoscută, este descrisă ca o boală multifactorială care implică atât componente genetice, cât și componente de mediu. 2

Există multe modele animale și variabile ale inflamației colonului care seamănă cu mai multe caracteristici ale IBD. Modelele animale de colită variază de la cele care apar spontan în tulpini sensibile ale anumitor specii la cele care necesită administrarea de concentrații specifice de substanțe chimice care induc colita, cum ar fi sulfatul de dextran de sodiu (DSS). Modelele de inflamație intestinală induse chimic sunt cele mai frecvent utilizate și cele mai bine descrise modele de IBD. Administrarea DSS în apa potabilă produce colită acută sau cronică, în funcție de protocolul de administrare. 3 animale care au primit SSD prezintă pierderea în greutate și semne de scaune libere sau diaree, uneori cu dovezi de sângerare rectală 4,5. Aici, descriem metodele prin care dezvoltarea colitei și răspunsul inflamator rezultat pot fi caracterizate după administrarea DSS. Aceste metode includ analiza histologică a secțiunilor de colon colorate cu hematoxilină/eozină, măsurarea citokinelor pro-inflamatorii și determinarea mieloperoxidazei (MPO), care poate fi utilizată ca marker pentru inflamație. 6

Amploarea răspunsului inflamator în starea de boală poate fi evaluată prin prezența simptomelor clinice sau prin modificarea histologiei în țesutul mucos. Daunele histologice ale colonului sunt evaluate folosind un sistem de notare care ia în considerare pierderea arhitecturii criptei, infiltrarea celulelor inflamatorii, îngroșarea mușchilor, epuizarea celulelor calice și cripta. 7 Cantitativ, nivelurile de citokine proinflamatorii acute cu proprietăți inflamatorii, cum ar fi interleukina (IL) -1β, IL-6 și factorul de necroză tumorală (TNF) -α, pot fi determinate folosind metodele ELISA clasice. În plus, activitatea MPO poate fi măsurată folosind un test colorimetric și utilizată ca indice de inflamație. 8

În colita experimentală, severitatea bolii se corelează adesea cu activitatea crescută a MPO și cu niveluri ridicate de citokine pro-inflamatorii. Severitatea colitei și inflamației asociate cu leziuni pot fi evaluate prin examinarea consistenței scaunului și a sângerării, pe lângă evaluarea stării histopatologice a intestinului utilizând secțiuni de colon tisular colorate cu hematoxilină/eozină. Fragmentele de țesut de colon pot fi utilizate pentru a determina activitatea MPO și producția de citokine. Luate împreună, aceste măsurători pot fi utilizate pentru a evalua răspunsul inflamator la modelele animale de colită experimentală.

Protocol

1. Modelul șoarecelui de colită acută indusă de DSS

2. Se colectează probe de țesut din colon

3. Evaluarea severității colitei

4. Pregătiți soluții standard de reactivi pentru testare.

Se prepară o soluție de 50 mM tampon fosfat de potasiu prin adăugarea soluției B (K 2 HPO 4, 8,7 g fosfat dibasic de potasiu în 1 L de dH 2 O) la soluția A (KH 2 PO 4, 6, 8 g fosfat de potasiu monobazic în 1L de DH20) până când se atinge un pH de 6,0. Soluțiile rămase pot fi păstrate la frigider (2-8 ° C) până la utilizare ulterioară.
Se prepară tampoane de bromură de hexadecil (CCFH) adăugând 5 g HTAB în 1 L tampon fosfat de potasiu (50 mM, pH = 6,0). Se încălzește ușor pentru a se dizolva și se păstrează la 2-8 ° C până la utilizare. Când este necesar, încălziți pentru a dizolva din nou.
Pregătiți un tampon de liză pentru omogenizarea țesutului pentru analiza proteinelor adăugând 10 ml de acid clorhidric Tris-1M (pH = 8,0), 6 ml de clorură de sodiu 5M și 2 ml de Triton X-100 până la 182 ml de apă distilată sterilizată. Triton X-100 este foarte vâscos la temperatura camerei și, prin urmare, trebuie încălzit ușor înainte de utilizare. Tamponul de liză preparat poate fi depozitat la -20 ° C până la utilizare.

5. Pregătirea probelor pentru analiză

6. Cuantificarea markerilor inflamatori

7. Rezultate reprezentative

figura 1. Șoarecilor masculi, C57BL/6 li s-a administrat DSS 5% în apă potabilă timp de 5 zile. Scorurile DAI au fost evaluate zilnic pentru fiecare animal și au fost mediate pe zi pentru fiecare grup (medie ± SEM, n = 4 șoareci/grup).

Figura 2. Șoarecilor C57BL/6 li s-a administrat DSS 5% în apă potabilă timp de 5 zile. Șoarecii de control au primit apă fără SSD. Scorul de deteriorare macroscopică/scorurile de severitate a bolii au fost evaluate orbește în ziua 5 după colita indusă de DSS. Coloanele izolate de la șoareci care au primit SSD au avut scoruri mari de daune brute (sângerări rectale, prolaps rectal, diaree, sângerări de colon) indicând o severitate mai mare a bolii (medie ± SEM, n = 4 șoareci/grup).

Figura 3. C57BL/6 a primit o soluție SSD 5% în apă potabilă pentru a induce colita. Șoarecii de control au primit apă fără SSD. (A) Scorurile histologice au fost clasificate orb în funcție de secțiunile colorate cu H&E ale țesutului colonic colectate în ziua 5 după administrarea DSS. (B) Probele prelucrate prin DSS prezintă mai multe daune histologice (mai multă infiltrare celulară, epuizare mai mare a celulelor calice, distorsiune/deteriorare mai mare arhitecturii criptei) comparativ cu controlul (C) (medie ± SEM, n = 4 șoareci/grup). În (B) și (C), asteriscul (*) indică zona de epuizare a celulei calice și distorsiunea arhitecturii criptei; semnul lirei (#) indică infiltrarea celulelor.

Figura 4. Toți șoarecii au fost sacrificați după administrare după ziua 5 de DSS și probele de țesut de colon au fost colectate pentru a evalua activitatea MPO. Severitatea colitei induse de DSS este asociată cu niveluri mai ridicate de activitate MPO comparativ cu martorii (medie ± SEM, n = 4 șoareci/grup).

_upload/3678/3678fig5.jpg "/>
Figura 5. În plus față de nivelurile mai ridicate de MPO, severitatea colitei induse de DSS este, de asemenea, asociată cu un nivel crescut de citokine pro-inflamatorii, cum ar fi IL-1β, IL-6, TNF-α (medie ± SEM, n = 4 șoareci/grup ).

tabelul 1. Scorul/boala de severitate macroscopică

Abonament necesar. Vă rugăm să recomandați JoVE bibliotecarului dvs.

Discuţie

Colita DSS este un model de inflamație intestinală indus chimic pe scară largă. În acest model, șoarecilor li se administrează apă potabilă suplimentată cu MAS, despre care se crede că este toxică pentru celulele epiteliale intestinale și perturbă integritatea barierei mucoasei. Administrarea DSS induce colita acută care se caracterizează prin scaune libere, sângerări fecale și infiltrare cu granulocite. 10 În timpul administrării DSS, colita este în general asociată cu pierderea semnificativă în greutate și prezența sângelui în scaun, care poate fi evaluată printr-un test de sânge ocult în scaun. 5.10,11 După colectarea probelor de țesut de colon, severitatea colitei poate fi caracterizată prin examinarea grosieră a colonului și analiza histologică a secțiunilor de colon colorate cu H&E utilizând sisteme de notare stabilite anterior. 9

Atunci când urmați acest protocol, este important să rețineți că severitatea colitei indusă de DSS este specifică speciei și tulpinii. 12 În plus, diferențele în microflora intestinală între diferite unități de animale și camere de adăpostire pot modifica rezultatul administrării MAS. 13,14 Astfel, pot fi necesare studii inițiale care utilizează DSS pentru a optimiza doza și durata tratamentului pentru MAS. Nerespectarea acestor variabile poate duce la o incidență ridicată a decesului sau colită mică sau deloc. Odată optimizat, acest model poate fi utilizat ca model de colită foarte reproductibil, cu o rată scăzută a mortalității. În plus, este important să se utilizeze DSS cu greutatea moleculară specificată (a se vedea tabelul reactivilor). Alte forme de reactiv de sare DSS pot să nu producă colită sau ar putea duce la o incidență ridicată a decesului.

Pentru cea mai exactă măsură a activității MPO, am constatat că, indiferent de modelul de colită utilizat, nivelurile de MPO trebuie stabilite în prima săptămână de colectare a țesuturilor, deoarece activitatea MPO tinde să scadă în timp. Activitatea MPO poate fi utilizată ca marker pentru inflamație. Cu toate acestea, cuantificarea citokinelor tisulare și scorul histologic sunt esențiale pentru facilitarea evaluării cuprinzătoare a răspunsului inflamator în timpul colitei.

Abonament necesar. Vă rugăm să recomandați JoVE bibliotecarului dvs.