Șoarecele tratat cu cefoperazonă Model relevant clinic Tulpina Clostridium difficile R20291

rezumat

Acest protocol descrie modelul cefoperazonei de șoarece a infecției cu Clostridium difficile (CDI) folosind o tulpină relevantă clinic și tratabilă genetic, R20291. Accentul pus pe supravegherea clinică a bolii C., enumerarea bacteriană dificilă, citotoxicitatea toxinei și modificările histopatologice în CDI într-un model de șoarece sunt detaliate în protocol.

Introducere

Clostridium difficile este un bacil anaerob, gram-pozitiv care formează spori, care provoacă diaree care pune viața în pericol 1. Infecția cu C. difficile (CDI) este asociată cu morbiditate și mortalitate umană crescute și are ca rezultat costuri de peste 4,8 miliarde USD pe an. În 2013, Centrele pentru Controlul și Prevenirea Bolilor au clasificat C. difficile drept un risc urgent pentru rezistența la antibiotice, indicând faptul că reprezintă o amenințare urgentă pentru sănătatea publică 1. În prezent, tratamentul cu antibiotice vancomicină și metronidazol sunt considerate standard de îngrijire pentru CDI 5 Din păcate, recurența CDI după tratamentul cu succes cu antibiotice este mare, apărând la 20 - 30% dintre pacienți 2,5-7. Prin urmare, este necesară descoperirea de noi agenți terapeutici împotriva acestui agent patogen enteric. Pentru a evalua terapia împotriva C. difficile, este necesară o tulpină relevantă din punct de vedere linic un model animal care se apropie de boala AC umană.

În primul rând, postulatele lui Koch au fost stabilite pentru C. difficile în 1977 folosind un model de hamster sirian tratat cu clindamicină 8. Acest model este folosit și astăzi pentru a studia efectele toxinelor C. difficile asupra patogenezei 9.10. Cu toate acestea, CDI în modelul de hamster are ca rezultat rate de mortalitate ridicate și nu se apropie de manifestările cronice ale bolii insidioase care pot fi observate la om cu CDI 10,11. Pe baza accesibilității și disponibilității platformelor de mouse responsive în căutarea unui model de mouse de CDI este relevant.

În 2008, un model robust de șoarece de CDI a fost creat prin tratarea șoarecilor cu un cocktail de antibiotice în apă potabilă (kanamicină, gentamicină, colistină, metronidazol și vancomicină) timp de 3 zile, urmată de o injecție intraperitoneală de clindamicină 12. Acest șoarece a făcut susceptibil la CDI și colită severă. În funcție de doza de inoculum administrată, se poate observa o serie de semne clinice și letalitate folosind acest model. De atunci, au fost studiate diferite tratamente antibiotice care modifică microbiota intestinului murin, scăzând rezistența la colonizare până la punctul în care C. difficile poate coloniza tractul gastro-intestinal (revizuite în Best et al. Și Lawley & Young) 13.14.

Mai recent, o cefalosporină cu spectru larg, cefoperazonă, administrată în apă potabilă timp de 5 sau 10 zile face șoarecii susceptibili la CDI reproductibili 15. Deoarece administrarea cefalosporinelor de a treia generație este asociată cu un risc crescut de CDI la om, utilizarea cefoperazonei modelul reflectă mai îndeaproape boala naturală 16. Șoarecii tratați cu cefoperazonă susceptibili la C. difficile au fost eliberați atât cu spori de C. difficile, cât și cu celule vegetative din diferite tulpini clinice variind în relevanță și virulență 17. În ciuda unora dintre studiile originale care utilizează celule vegetative de C. difficile. considerat modul principal de transmisie 18.

În ultimul deceniu, C. difficile R20291, tulpina NAP1/BI/027, a apărut, provocând epidemii de CDI 19,20. Am căutat să determinăm evoluția clinică a bolii atunci când șoarecii tratați cu cefoperazonă au fost expuși la tulpina de C. difficile relevantă clinic și tratabilă genetic, R20291. Acest protocol detaliază evoluția clinică, incluzând pierderea în greutate, colonizarea bacteriană, citotoxicitatea toxinei și modificările histopatologice ale tractului gastro-intestinal al șoarecilor infectați cu spori C.2020 difficile R20291. În general, acest model de șoarece se dovedește a fi o platformă experimentală valoroasă pentru CDI care se apropie de boala umană. Prin urmare, acest model de șoarece caracterizat poate fi utilizat pentru a evalua efectele noilor terapii asupra ameliorării bolii clinice și asupra restabilirii rezistenței la colonizare împotriva C. difficile.

Abonament necesar. Vă rugăm să recomandați JoVE bibliotecarului dvs.

Protocol

Declarație etică:
Comisia instituțională de îngrijire și utilizare a animalelor (IACUC) de la Colegiul de Medicină Veterinară al Universității de Stat din Carolina de Nord (NCSU) a aprobat acest studiu. Politica NCSU de îngrijire și utilizare a animalelor aplică standardele și liniile directoare stabilite în Legea privind extinderea cercetării de bunăstare și sănătate a animalelor de laborator din 1985. Facilitățile pentru animale de companie de la NCSU respectă liniile directoare stabilite în Ghidul pentru îngrijirea și utilizarea animalelor de laborator. Condiții de sănătate Animalele au fost evaluate zilnic, iar animalele moribunde au fost eutanasiate uman prin asfixierea CO2 urmată de măsuri secundare. tehnicieni instruiți pentru animale sau un medic veterinar au efectuat reproducerea într-o unitate AAALAC acreditată în timpul acestui studiu.

1. Administrarea antibioticului cefoperazonă în apa potabilă pentru a atinge sensibilitatea la C. difficile Colonizare și boală

NOTE:/6 șoareci WT cu vârsta cuprinsă între 5 și 8 săptămâni C57BL (de sex feminin și masculin) au fost cumpărați și puși în carantină timp de 1 săptămână înainte de începerea administrării de antibiotice de apă. După carantină, șoarecii au fost adăpostiți cu hrană autoclavată, așternuturi și apă. Schimbările în cușcă au fost efectuate săptămânal de către personalul laboratorului într-o hotă cu flux laminar.

  1. Pregătiți cefoperazonă (0,5 mg/ml) în apă distilată sterilă cu 7 zile înainte de ziua țintă de provocare (Figura 1).
  2. Umpleți sticlele de apă autoclavate cu apă de cefoperazonă (0,5 mg/ml) și puneți-le în fiecare cușcă de șoarece.
    NOTĂ: Apa de cefoperazonă proaspăt preparată trebuie făcută și schimbată la fiecare 2 zile pentru o perioadă de 5 zile, după cum se menționează la pașii 1.1 și 1.2. Se recomandă eliminarea adecvată a apei de cefoperazonă în conformitate cu liniile directoare instituționale de sănătate și siguranță a mediului.
  3. După 5 zile pe apă cu cefoperazonă, înlocuiți sticlele cu sticle de apă autoclavate umplute cu apă distilată sterilă. Dați șoarecelui și apei potabile pe durata experimentului.

2. Pregătirea inoculului de spori de C. difficile și gavajul șoarecilor

NOTĂ: Înainte de a începe, asigurați-vă că următoarele sunt plasate în camera anaerobă timp de cel puțin 24 de ore: 1x soluție salină tamponată cu fosfat (PBS; vezi Materiale), plăci de cicloserină taurocolat cefoxitină fructoză agar (TCCFA) (vezi Materiale și fișa suplimentară) și un retractor steril în formă de L.

NOTĂ: Șoarecii cu spori de C. difficile ar trebui să fie găzduiți într-o instalație pentru animale de companie de nivel 2 pentru biosecuritate.

3. Monitorizarea pierderii în greutate a șoarecilor și a semnelor clinice ale bolii pe tot parcursul infecției cu C. difficile

4. Enumerarea bacteriană a fecalelor de șoareci C. difficile și a conținutului de cecum

NOTĂ: Înainte de a începe, asigurați-vă că următoarele elemente sunt plasate în camera anaerobă timp de cel puțin 24 de ore: 1x PBS (a se vedea Materiale), plăci TCCFA (a se vedea Materiale), un retractor steril în formă de L și microtuburi sterile și/sau Plăci PCR pentru diluții.

5. Testul de citotoxicitate a celulelor Vero pentru a cuantifica Citotoxivila de toxină C. difficile

NOTĂ: Se recomandă ca această analiză să fie efectuată după finalizarea modelului de șoarece pe probe prelevate la autopsie și depozitate la -80 ° C. Tehnicile de cultură a celulelor aseptice sunt esențiale pentru a preveni contaminarea celulelor Vero în timpul acestui test. Acest protocol durează 2 zile. Toate fecalele și conținutul intestinal utilizate în acest test trebuie depozitate într-un tub de centrifugă cântărit steril (notat cu „greutatea tubului”, vezi secțiunea de mai sus). Greutatea tubului final (inclusiv conținutul) este măsurată printr-o scară analitică la patru zecimale (vezi secțiunea de mai sus). Utilizarea unei pipete multi-canal este recomandată pentru acest test.

NOTĂ: Înainte de a începe, asigurați-vă că sunt disponibile următoarele: celulele Vero, o modificare Dulbecco a Eagle's Medium (DMEM) 1x cu 10% ser fetal bovin inactivat la căldură (FBS) și 1% Penicilină/streptomicină (denumită "1x mediu DMEM; "vezi Materiale și fișier suplimentar), 0,25% Trypsin-EDTA, 1x PBS, 0,4% Trypan Blue, o cultură celulară placă cu 96 de godeuri, o placă cu filtru cu 96 de godeuri, Clostridium difficile Toxină A (3 µl alicot la 1 µg/µl în apă ultrapură și depozitați la -80 ° C), antitoxină Clostridium difficile, foaie de lucru (pentru calcule și plăci de hărți; consultați fișierele suplimentare).

NOTĂ: Ar trebui să se ia precauție în timpul acestui test pentru expunerea personalului la C. difficile și toxina acestuia.

Abonament necesar. Vă rugăm să recomandați JoVE bibliotecarului dvs.

Rezultate reprezentative

Într-un studiu reprezentativ, șoarecii C57BL/6 WT de 5 săptămâni au fost pretratați cu cefoperazonă în apa lor de băut (0,5 mg/ml) timp de 5 zile și li s-a permis spălarea cu apă pe zi. Șoarecii au fost provocați cu 5-10 spori de C. difficile R20291 prin gavaj oral în ziua 0 (figura 1A). Șoarecii au fost monitorizați pentru scăderea în greutate și semne clinice (letargie, inapetență, diaree și o postură încurcată) de CDI timp de 14 zile. Provocarea șoarecilor C57BL/6 WT cu spori de C. difficile R20291 a dus la diaree în 24 de ore și pierderea semnificativă în greutate în 48 de ore de la provocare (figura 1B). Deși nu au fost observați în acest experiment, șoarecii cu o doză mai mare de C. difficile R20291 se pot îmbolnăvi grav sau pot avea o pierdere în greutate mai mare de 20% la 48-72 de ore după provocare, necesitând astfel eutanasie. Prin urmare, șoarecii au nevoie de o monitorizare de cel puțin două ori pe zi după provocarea cu spori de C. difficile.

În acest studiu reprezentativ, o cantitate semnificativă de pierdere în greutate și semne clinice de boală la șoareci au fost, de asemenea, observate în zilele 2-7 după provocare (figura 1B). La 7 zile după provocare, șoarecii au început să se îngrașe, iar semnele clinice ale bolii s-au potolit. În ultima săptămână a experimentului, șoarecii au apărut din punct de vedere clinic normal, fără nicio dovadă de semne clinice ale CDI, inclusiv diaree.

Peletele fecale au fost colectate înainte de provocare cu spori de C. difficile și fiecare 48 de ore după provocare. (figura 1C). Înainte de tratamentul cu antibiotice, șoarecii nu erau colonizați cu C. difficile. După 24 de ore de provocare cu spori de C. difficile, șoarecii au fost colonizați cu 10 7 CFU de C. difficile per g de fecale. (Figura 1C). Șoarecii au rămas în mod constant colonizați cu C. difficile pe tot parcursul experimentului, în ciuda absenței dovezilor privind pierderea în greutate sau a semnelor clinice ale CDI în ultimele 7 zile ale experimentului.

Patru șoareci (2 bărbați și 2 femele) au fost eutanasiați uman și pregătiți pentru necropsie în ziua 0, înainte de infecție, pentru a servi drept martori neinfectați. În plus, un șoarece din fiecare cușcă a fost eutanasiat uman și pregătit pentru necropsie în zilele 2, 4, 7 și 14 după provocare. (figura 1A). Enumerarea C. difficile în conținutul cecului a fost efectuată la fiecare necropsie. În concordanță cu enumerarea fecală, nu a fost detectat C. difficile în conținutul de cecum al șoarecilor înainte de provocarea cu C. difficile. La 48 de ore după provocare, șoarecii au fost colonizați cu aproximativ 10 8 CFU de C. difficile per g de conținut cecal. (Figura2A). Toți șoarecii au rămas constant colonizați pe tot parcursul experimentului.

Conținutul cecului a fost, de asemenea, evaluat în infecție pentru prezența toxinei C. difficile utilizând testul de citotoxicitate a celulelor Vero. Nici o dovadă de citotoxicitate a toxinei C. difficile nu a fost detectată la fecale înainte de provocare (figura 2B). Citotoxicitatea C. difficile a fost detectată la 2 zile după provocarea cu sporii C. difficile și a persistat pe tot parcursul infecției. În ciuda colonizării destul de uniforme de către C. difficile, variațiile nivelurilor activității citotoxice ale C. difficile sunt evidente la șoareci individuali. (figura 2B).

tratat

Figura 2: Colonizarea cecului și citotoxicitatea în timpul din ' infecție cu C. difficile R20291. LA) Cecul de șoarece a rămas constant colonizat cu C. difficile pe tot parcursul experimentului, în ciuda rezolvării semnelor clinice și a creșterii în greutate observate. Toți șoarecii au fost colonizați cu mai mult de 108 CFU pe gram de fecale atunci când au fost evaluați la 2 zile după provocare. B) Citotoxicitatea celulelor Vero testează conținutul cecului orice infecție cu C. difficile R20291. După provocarea cu spori de C. difficile, șoarecii au avut niveluri semnificative de citotoxicitate, așa cum s-a măsurat în jurnalul Diluarea reciprocă a toxinei pe gram de conținut de cecal în zilele 2, 4 și 7 după provocare versus ziua 0 (mediane reprezentate de linie). Semnificația a fost determinată de testul ANOVA unidirecțional nonparametric Kruskal-Wallis urmat de post-testul lui Dunn (*, p ≤ 0,05; ** p ≤ 0,01; *** p ≤ 0,001, ** **, p ≤ 0,0001). Barele de eroare reprezintă abateri standard ale mediei. Faceți clic aici pentru a vizualiza o versiune mai mare a acestei figuri.

Se recomandă ca evaluarea histologică să fie efectuată de un medic veterinar orb certificat de bord. Pentru a puncta țesutul, ar trebui să se utilizeze un sistem de punctare a numărului 0-4 pentru a evalua separat edemul, infiltrarea celulelor inflamatorii și leziunile celulelor epiteliale în ileon, cec și colon pe baza unui sistem.

După examinarea histopatologică a ileonului murin, a cecului și a colonului după jaluzele cu C. difficile R20291, cele mai importante modificări patologice au fost observate în cecum (Figura 3). Scorurile histologice cecale totale au fost semnificativ diferite între Ziua 0 și Ziua 2 și Ziua 4 după provocare. Nu s-au observat leziuni semnificative în ileon pe toată durata infecției. (Figura 3). Au fost observate leziuni mai ușoare la nivelul colonului. Scorurile histologice totale ale colonului au fost semnificativ diferite între ziua 0 și ziua 2 și după provocarea 7 (figura 3).

Secțiunile reprezentând H&E ale ileonului, cecului și colonului prin infecție sunt disponibile la figura 4. Fiecare imagine are scorul său histologic total și scorurile individuale pentru afectarea epitelială, inflamație și edem, așa cum este determinat de un medic veterinar nevăzător certificat (SAM).


Figura 3: notația histologică a ileonului murin, a cecului și a colonului în timpul din ' infecție cu C. difficile R20291. Scorurile histologice totale au fost calculate prin însumarea celor trei scoruri ale parametrilor evaluați: leziuni epiteliale, inflamație și edem. Nu s-au observat modificări histopatologice semnificative în ileon, nici o infecție. Țesutul cecal conținea cele mai semnificative leziuni histologice în timpul CDI. Scorurile histologice cecale totale au fost semnificativ diferite de ziua 0 până la zilele 2 și 4 post-provocare. Au fost observate leziuni mai ușoare la nivelul colonului. Scorurile histologice totale colonice au fost semnificativ diferite de ziua 0 zile 2 și 7 post-provocare. Semnificația a fost determinată de testul ANOVA unidirecțional nonparametric Kruskal-Wallis urmat de post-testul lui Dunn (*, p ≤ 0,05; ** p ≤ 0,01; ***, p804; 0,001; * ***, P ≤ 0,0001). Barele de eroare reprezintă abateri standard ale mediei. Faceți clic aici pentru a vizualiza o versiune mai mare a acestei figuri.


Figura 4: Histopatologie în timpul infecție cu C. difficile R20291. Acest panou conține secțiuni reprezentative H&E ale ileonului, cecului și colonului prin infecția cu C. difficile R20291. Scorurile histologice totale sunt între paranteze () pentru ziua corespunzătoare și țesuturile enumerate: pentru ileon ziua 0 (0), ziua 2 (1), ziua 4 (0), ziua 7 (0) și ziua 14 (0); pentru cecum ziua 0 (0), ziua 2 (5), 4 zile (4), 7 zile (3) și 14 zile (3); iar pentru colonul ziua 0 (0), ziua 2 (4), 4 zile (1), 7 zile (4) și 14 zile (2). Fotomicrografiile au fost obținute pe un microscop cu lumină cu o cameră digitală de 5 megapixeli și software-ul însoțitor (bara de scară reprezintă 200 µm). Faceți clic aici pentru a vizualiza o versiune mai mare a acestei figuri.

Abonament necesar. Vă rugăm să recomandați JoVE bibliotecarului dvs.