Structură separare macromoleculă acid amină electroforeză tutoriale Predare și

1. Un amestec din următorii aminoacizi este supus electroforezei hârtiei la pH 3,9: A, S, F, L, R, D, H. Care aminoacizi migrează către anod? Care aminoacizi migrează către catod ?

2. De ce aminoacizii cu aceeași sarcină se separă foarte ușor în timpul electroforezei (exemplu: Gly vs. Leu) ?

3. Luați în considerare amestecul de aminoacizi A, V, E, K, T la pH 6. Care este profilul de migrație după electroforeză pe hârtie? Indicați locația depozitului, a anodului, a catodului și a oricărui aminoacizi nedespărțiți. Care produs ajută la dezvăluirea aminoacizilor ?

Principiul și utilizarea electroforezei

Scopul electroforezei este de a separa moleculele încărcate printr-un gel (un polimer) sub efectul unui câmp electric .

Moleculele se deplasează spre polul de sarcină opus sarcinii lor nete z, la o viteză v proporțională cu această sarcină: v = E. z/f

  • E este puterea câmpului electric
  • f este forța de frecare

Prin urmare, separarea electroforetică se face în funcție de raportul [sarcină/masă] .

Mobilitatea electroforetică a unei molecule poate fi exprimată (într-un mod simplificat) prin relația: mobilitate = k. (pH - pI)/masa molară

unde pI este punctul izoelectric al moleculei.

Luați în considerare o proteină de pI = 5:

  • dacă pH-ul tamponului utilizat pentru cromatografie este mai mic decât pI al proteinei (zona albastră - figura de mai jos), acesta din urmă este încărcat pozitiv: trebuie utilizat un schimbător de cationi
  • dacă pH-ul tamponului utilizat pentru cromatografie este mai mare decât pI al proteinei (zona roșie), acesta din urmă este încărcat negativ: trebuie utilizat un schimbător de anioni.

acid

Electroforeza permite, printre altele, să:

Întrebarea 1. În cazul amestecului de aminoacizi (A, S, F, L, R, D, H.) supus electroforezei hârtiei la pH 3,9:
Amino acid pI încărcare la pH 3,9 direcția de migrare
LA 6 + catod
S 5.7 + catod
F 5.5 + catod
L 6 + catod
R 10.8 +++ catod
D 2.9 - anod
H 7.6 ++ catod
Notă: în funcție de sursă, valorile pI sau pKa diferă ușor.

Întrebarea 2. Separarea electroforetică se face în funcție de raportul încărcare/masă .

Prin urmare, Gly migrează mai mult decât Leu, deoarece chiar dacă au aceeași încărcare, Gly are un lanț lateral mai puțin voluminos, deci o masă mai mică (Gly: 57,02/Leu: 113,08).

Întrebarea 3. Profilul de separare electroforetic al amestecului: A, V, E, K, T la pH 6.
Amino acid pI încărcare la pH 6 direcția de migrare
LA 6 neutru nu migrați
V 6 neutru nu migrați
E 3.2 negativ anod
K 9.6 pozitiv catod
T 5.6 ușor negativ migrație ușoară a anodului

Ninhidrina ajută la dezvăluirea aminoacizilor.

  • Violetul lui Ruhemann (λ = 570 nm) este culoarea caracteristică a produsului de reacție al aminoacizilor colorați cu ninhidrină.
  • Cu excepția prolinei și hidroxiprolinei care sunt colorate în galben (λ = 440 nm).

alifatic (hidrocarbură saturată)

Ala: grupare metil

Val, Leu & Ile: lanț ramificat

Ile conține 2 atomi de carbon asimetrici (4 stereoizomeri)

Lanțul lateral al acidului α-imină (grupa amino secundară) legat atât de gruparea α-carboxil, cât și de gruparea α-amino

structură specială care impune modificări în direcția legăturii carbonilor α ai lanțurilor polipeptidice

adesea pe suprafața proteinelor unde stabilesc legături de hidrogen sau punți de sare (solvent sau alte molecule)

gruparea β - hidroxil

adesea pe suprafața proteinelor unde stabilesc legături de hidrogen sau punți de sare (solvent sau alte molecule