Modelarea complexului receptor muscarinic/toxic MT7 din date termodinamice

Modelarea complexului receptor muscarinic/toxic MT7 din datele termodinamice Guillaume Letellier Pentru a cita această versiune: Guillaume Letellier. Modelarea complexului receptor muscarinic/toxic MT7 din date termodinamice. Științele vieții [q-bio]. Universitatea Paris-Diderot - Paris VII, 2008. franceză. tel-00447060 HAL Id: tel-00447060 https://tel.archives-ouvertes.fr/tel-00447060 Depus la 14 ianuarie 2010 HAL este o arhivă multidisciplinară cu acces deschis pentru depunerea și diseminarea documentelor de cercetare științifică sunt publicate sau nu. Documentele pot proveni de la instituții de predare și cercetare din Franța sau din străinătate sau de la centre de cercetare publice sau private. Arhiva deschisă multidisciplinară HAL este destinată depunerii și diseminării documentelor științifice la nivel de cercetare, publicate sau nu, de la instituții de învățământ și cercetare franceze sau străine, laboratoare publice sau private.

Școala doctorală inter /// Bio Modelarea complexului receptorului muscarinic/toxina MT7 din date termodinamice Prezentat și susținut public la 8 octombrie 2008 Pentru obținerea diplomei de doctor de la Universitatea Denis Diderot Specialitatea în analiza genomului și modelarea moleculară de GUILLAUME LETELLIER Compoziția juriul: Directorul tezei: Dr. Bernard GILQUIN Raportori: Examinatori: Dr. Michael NILGES Dr. Serge CROUZY Prof. Catherine ETCHEBEST, președinte Prof. Marc LE MAIRE Dr. Denis SERVENT CEA/iBiTec-S/SB2SM/LBSR CEA Saclay, 91191 Gif sur Yvette

Capitolul 1: Abrevieri AR Receptor adrenergic Ach Acetilcolină ADN Acid dezoxiribonucleic AFM Microscopie cu forță atomică AMPc Adenozină monofosfat ciclic TCM Model complex ternar CHO Hamster chinezesc ovar DAG Diacilglicerol egfp Proteină îmbunătățită de transfer fluorescent verde FRET Fluorescență sau FTD -fosfat HADDOCK Andocare biomoleculară cu ambiguitate ridicată hm1 Subtipul receptorului muscarinic uman 1 hm3 Subtipul receptorului muscarinic uman 3 IP3 Inozitol tri-trifosfat M molar (mol.l -1) machr Receptor muscarinic al acetilcolinei Toxină muscarinică nm nanomolar -NMS N-metilscopol nanosecunda PDB Protein kinase A PKC Protein kinase A PKC Protein kinase C PLC Phospholipase type C pm picomolar RCPG Protein coupled receptor G RMN Rezonanță magnetică nucleară RMSD Medie pătratică de interes SDS-Pagina S electroforeză pe gel de poliacrilamidă cu odiu dodecil sulfat TCM Modelul complexului ternar TM Domeniul transmembranar 4

Capitolul 1: Introducere 5.1.2. Date care nu sunt luate în considerare 147 5.1.2.1. W91 M1/Y30 tox 147 R52 tox/W400 M1 149 5.2. Dimerizarea receptorilor muscarinici 150 5.2.1. Natura suprafeței de interacțiune 150 5.2.2. Modul de asamblare a dimerului receptorului 151 5.2.3. Oligomeri de ordin superior 154 5.3. Baza moleculară a proprietăților farmacologice ale toxinei 156 5.3.1. Link site 156 5.3.2. Stoichiometrie NMS/MT7/hm1 156 5.3.2.1. Ipoteza 1: 1 dimer al M1, 1 toxină, 1 NMS 156 5.3.2.2. Ipoteza 2: 1 dimer de M1, 2 toxine, 2 NMS 157 5.3.3. Afinitate mare de legare 158 5.3.4. Selectivitatea pentru subtipul receptorului muscarinic M1 161 Capitolul 6: Concluzii și perspective 164 6.1. Perspective: bazele moleculare ale alosteriei 166 Capitolul 7: Indexul figurilor 171 Capitolul 8: Bibliografie 175 Capitolul 9: Anexe 190 9.1.1. Liganzi ortosterici ai RCPG 191 9.1.2. Alinierea secvențelor hm1 și rodopsină 192 9.1.3. Simulare de depozitare 193 9.1.4. Simulare dinamică moleculară activată 196 9.1.5. Simulări ale dinamicii moleculare în membrană 198 9.1.6. Reper al codurilor de dinamică moleculară pe aparatul TERA10 200 8

Capitolul 1 Introducere

Capitolul 1: Introducere Figura 4: Structura rodopsinei bovine Domeniul extracelular este prezentat în mov și bucla E2 în roșu. Pe baza coordonatelor PDB 1U19 (Okada, Sugihara și colab. 2004). 17

Capitolul 1: Introducere 1.4.1. Subtipuri de receptori muscarinici În urma secvențierii genomului uman, a apărut că există mai multe subtipuri de receptori muscarinici la om, cu asemănări de secvență foarte mari (Figura 11). În prezent, la om sunt cunoscute 5 subtipuri de receptori muscarinici. În timp ce cei care poartă numere pare (1, 3, 5) sunt cuplați preferențial la calea inozitol-trifosfat, cei care poartă numere impare sunt cuplați în schimb la calea amplificatorului ciclic. Localizarea receptorilor muscarinici a fost studiată pe larg (Abrams, Andersson și colab. 2006). Acestea sunt distribuite în multe organe, cum ar fi vezica urinară, intestinul, glandele salivare, inima, ochiul etc. O atenție deosebită a fost acordată distribuției lor în creier (Volpicelli și Levey 2004) unde joacă, printre altele, roluri în excitabilitatea neuronală, plasticitatea sinaptică, precum și mecanisme de feedback asupra acetilcolinei. Cei 5 receptori sunt exprimați în diferite regiuni ale creierului. Subtipurile M1, M4 și M5 sunt, de exemplu, localizate în sistemul nervos central, în timp ce subtipurile hm2, 3 sunt prezente în sistemul nervos periferic. 30

Capitolul 1: Introducere Figura 11: Alinierea secvenței celor 5 subtipuri de receptor muscarinic Helicele transmembranare sunt indicate de benzile verzi 31

Capitolul 1: Introducere rodopsina: cavitatea de legare a retinei, această cavitate fiind localizată adânc în inima pachetului de helix. (A) Figura 13: Modelul situsului de legare ortosterică a receptorului hm1 A) ligand endogen, acetilcolina (magenta). B) un antagonist ortosteric, N-metilcopolamina (magenta) Conform Goodwin (Goodwin, Hulme și colab. 2007) (B) 34

Capitolul 1: Introducere Figura 14: Legarea liganzilor orto și alosterici de receptorul muscarinic M2 Cei doi liganzi sunt în galben, reziduurile Y177 și W422 ale receptorului muscarinic M2 în roșu. Potrivit lui Jager (Jager, Schmalenbach și colab. 2007) 36

Capitolul 1: Introducere 1.5.2. Structura Toxinele muscarinice sunt o familie de peptide cu 65-66 reziduuri (Figura 16) cu 4 legături disulfură. În prezent sunt cunoscute o duzină în total, dar nu toate au fost secvențiate. Structura toxinei muscarinice MT2 (Figura 31) a fost rezolvată prin RMN (Segalas, Roumestand și colab. 1995) apoi prin cristalizare și difracție cu raze X la o rezoluție de 1,50 Å (cod PDB 1FF4). Această structură prezintă o pliere cu trei degete organizată în cinci fire β antiparalele interconectate prin trei bucle (I, II și III). Miezul proteinei este stabilizat de patru punți disulfură. Acest motiv structural este comun în multe familii de toxine de șarpe (Galat, Gross și colab. 2008), cum ar fi α-neurotoxine (Popot și Changeux 1984), fasciculine (Du, Marchot și colab. 1992) sau cardiotoxine. Figura 16: Alinierea secvențelor de toxină muscarinică Cele 4 punți disulfură sunt reprezentate sub secvențe Figura 17: Structura cristalografică a toxinei MT2 (cod PDB 1FF4) 38

Capitolul 1: Introducere Figura 19: Alinierea secvenței buclei de toxine II și a buclei receptorului E2 Putem vedea o similaritate de secvență tulburătoare între bucla de toxină II și bucla receptorului E2 (Figura 19) care ar putea sugera că toxina ar putea deplasa bucla receptorului și loc. 40

Capitolul 1: Introducere dificilă, dar mai realistă în ceea ce privește problemele biologiei decât problemele legate/legate la început. Criteriile de evaluare a modelului sunt: F nat: proporția de contacte native prevăzute/numărul de contacte ale L_rms nativ: complex RMSD pe atomii din coloana vertebrală a ligandului prin suprapunerea I_rms anticipat și nativ: receptorii RMSD pe atomii coloanei vertebrale a reziduuri la interfața dintre model și complexul nativ Pentru a avea o referință în termeni de RMSD, Chotia și colab. (C. Chothia 1986) au stabilit că în medie două determinări independente ale structurii cristalografice ale aceleiași proteine duc la devieri medii de 0,5 AT. În ceea ce privește structurile determinate de RMN, valorile diferențelor dintre modele pot ajunge la mai mult de 1,5 Å. 46

Capitolul 1: Introducere 3. În al treilea exemplu, complexul dintre upar și upa, au fost utilizate date termodinamice de la mutații în alanină. Complexele au fost generate prin introducerea constrângerilor la distanță derivate din analogia dintre upa și peptida inhibitoare. Complexele au fost sortate prin compararea valorilor variațiilor din energiile de legare calculate și experimentale. Pentru două dintre aceste complexe, structura cristalografică a fost publicată după această lucrare de modelare (Bourne, Talley și colab. 2005) (cod pdb 1VI5); (Huai, Mazar și colab. 2006; Schneider, Ader și colab. 2008) (codul PDB 2FD6). Această abordare poate fi validată prin compararea modelelor cu structurile cristalografice. Pentru complexul BgK/Kv11, modelul poate fi comparat cu datele recente obținute prin RMN în stare solidă (Schneider, Ader și colab. 2008). Pentru a compara aceste modele cu structurile cristaline folosim criteriile propuse de CAPRI și prezentate anterior (cf 1.6.3): Fnat, L-rms și I_rms. Trebuie remarcat faptul că, în competiția CAPRI, pentru fiecare țintă, fiecare grup poate prezenta mai multe soluții. În această lucrare de modelare a complexelor din date termodinamice, a fost propus un singur model. 52

Capitolul 1: Introducere (A) (B) (C) Figura 23: Suprapunerea modelului nachr-α7/α-cobratoxină cu structura cristalină AChBP/α-cobratoxină AChBP și α-cobratoxina sunt respectiv în verde și albastru. Pentru modelul nachr-a7 și a-cobratoxina sunt respectiv în violet și roșu. (C) Zoom pe situl de legare Suprapunerea elementelor structurale secundare ale celor două complexe dă o abatere de 2,3 Å de rmsd între model și structura cristalografică. Figura 23 arată că cele două structuri se suprapun, indicând faptul că poziția și orientarea toxinei au fost prezise corect. Când cei doi receptori se suprapun, diferența dintre C toxinelor (L-rms) este egală cu 4,4 Å. Abaterile majore sunt localizate în capetele buclelor toxinei și în bucla C a receptorului, o regiune care nu este foarte conservată între AChR-7 și AChBP (FIG. 23C). Flexibilitatea semnificativă a acestei regiuni este observată în mai multe structuri complexe de ligand cu AChBP (Celie, Kasheverov și colab. 2005; Hansen, Sulzenbacher și colab. 54

56 Capitolul 1: Introducere

Capitolul 1: Introducere (A) (B) (C) Figura 24 Modelarea canalului de potasiu A) modelul complexului KcsA/kaliotoxin derivat din datele RMN de Lange, Giller și colab. 2006, B) modelul complexului Kv1.1/BgK (BgK este în roșu cu lizină 25 în albastru; sunt reprezentate doar trei subunități Kv1.1 (cyan, verde și galben) C) model rafinat prin calcul în energiile de cuplare retur și prezentând trei legături de hidrogen la interfață. BgK este prezentat în panglică cu lizină 25 în galben; scheletul Kv1.1 este în verde. 58

Capitolul 1: Introducere Figura 25: Suprapunerea modelului și a structurii cristalografice upar/upa. Pentru structura cristalografică, upar și upa sunt respectiv în cian și portocaliu. Pentru modelul upa este roșu și cele trei domenii D1, D2 și D3 din upar sunt prezentate în roz, magenta și respectiv albastru. 1.6.6. Concluzie Aceste trei exemple arată că modelarea complexelor de proteine / proteine din date termodinamice conduce la structuri în acord destul de bun cu experiența, în special pentru reziduurile majore ale interacțiunii. Pe de altă parte, acestea arată limitele procedurii utilizate. Absența eșantionării receptorilor și a conformatorilor de ligand înainte de aplicarea procedurii de andocare nu permite luarea în considerare a flexibilității partenerilor. În cele din urmă, se pare că relaxarea complexului prin dinamica moleculară trebuie efectuată pentru a optimiza modelul și pentru a valida stabilitatea acestuia. 60

Capitolul 1: Introducere 61

Capitolul 2: Studiul structural al partenerilor Capitolul 2: Studiul structural al partenerilor 62

Capitolul 2: Studiul structural al partenerilor 2.1. Receptorul hm1 2.1.1. Secvențe peptidice Receptorii muscarinici au un segment N-terminal scurt de 21 de aminoacizi înainte de primul helix transmembranar (Figura 26A). S-a demonstrat (Weill, Galzi și colab. 1999) că absența acestui segment nu are nicio influență asupra legării liganzilor de receptor. O altă particularitate a receptorilor muscarinici este prezența unui domeniu intracelular mare I3 (Figura 26A). Acest domeniu lung de aproape 180 de aminoacizi este situat între helicile transmembranare 5 și 6. Receptorii muscarinici recombinați în care această parte intracelulară a fost înlocuită de o buclă mai scurtă (ștergerea reziduurilor 231 la 357) au fost construiți și caracterizați de grupul B. Ilien (Weill, Galzi și colab. 1999). În cele din urmă, situsurile de glicozilare au fost de asemenea mutate. Acești receptori recombinați au încă capacitatea de a-și lega liganzii și de a activa proteinele G. Secvența peptidică pe care o vom folosi pentru a modela hm1 este o formă cu segmentul N-ter trunchiat de la resturile 1 la 20, precum și forma scurtă a hm1. bucla I3 descrisă de Weill și colab. (Weill, Galzi și colab. 1999) (Figura 26B). 63

Capitolul 2: Studiul structural al partenerilor (A) Figura 26: Modificarea buclelor receptorului M1 Organizarea schematică a M1 sălbatic (A) și după modificare (B). partea Nter a fost ștearsă până la reziduul 20. Reziduurile 231 până la 357 ale buclei intracelulare I3 sunt de asemenea șterse. (B) 2.1.2. Modelarea nucleului helix Rhodopsin a fost singura structură RCPG disponibilă la începutul acestei lucrări. Prin urmare, a fost folosit ca bază pentru a construi un model al pachetului de helix al receptorului muscarinic prin modelare comparativă. În ciuda valorilor de identitate a secvenței relativ scăzute între cele două proteine (24% în spirale), alinierea lor este neechivocă din cauza prezenței unor zone de conservare ridicată în interiorul spiralelor (Baldwin, Schertler și colab. 1997). 2.1.3. Predicția buclelor Bucla E1 a receptorului hm1 a fost modelată prin comparație cu cea a rodopsinei (FIG. 27) cu care are o similaritate rezonabilă (30%). Prezența punții disulfură între reziduul 178 al buclei E2 și reziduul 98 aparținând unei spirale transmembranare constrânge conformația bazei buclei la o conformație similară cu cea a rodopsinei. Prin urmare, aceste reziduuri sunt 64

Capitolul 2: Studiul structural al partenerilor modelat și de omologie. Pe de altă parte, structura rodopsinei nu constituie un model adecvat pentru prezicerea conformațiilor de la capătul buclei E2, precum și ale buclei E3. Sfârșitul buclei E2 (169-177) a fost deci prezis în întregime de novo cu ajutorul programului RAPPER (Furnham, Dore și colab. 2006). Pentru bucla E3 (391-396) programul RAPPER a identificat un fragment în PDB (cod 1KQF) pentru a ghida predicția. Cele 38 de molecule de apă interne structurii cristaline a rodopsinei au fost, de asemenea, conservate în modelul hm1 (Figura 28). Modelul final a fost evaluat de serverul RAMPAGE (Lovell, Davis și colab. 2003). Se observă în Figura 29 că 98% din reziduuri se găsesc în regiunile autorizate ale diagramei Ramachandran (Ramachandran, Ramakrishnan și colab. 1963). Prin urmare, acest model nu are defecte majore în geometria sa. Figura 27: Alinierea secvențelor buclelor extracelulare E1 ale rodopsinei și ale hm1 Figura 28: Modelul receptorului hm1 Modelul este construit prin omologie pe baza structurii rodopsinei. 65

Capitolul 2: Studiu structural al partenerilor Figura 29: Diagrama Ramachandran a modelului hm1 Numărul de reziduuri din regiunile favorabile: 265 (92,7%) Numărul de reziduuri din regiunile autorizate: 14 (4,9%) Numărul de reziduuri din regiunile interzise: 7 ( 2,4%) 66

Capitolul 2: Studiul structural al partenerilor pentru a avea un model fiabil al ligandului nostru și pentru a ne elibera de posibile artefacte structurale datorate prezenței iodului sau altoirii buclei unei alte toxine. (A) Figura 30: Structura cristalină a toxinei MT7 modificate (a) MT7 care poartă doi atomi de iod (în roșu) pe tir51. (b) Himera MT7 cu o buclă III de MT1 (în verde) (B) (A) Figura 31: Comparația structurilor MT7 modificate cu MT2 A) Himera MT1/MT7 (cian) suprapusă structurii MT2 (albastru) ). B) toxina di-iodică (magenta) suprapusă pe MT2 (albastră). (B) 68

Capitolul 2: Studiul structural al partenerilor Figura 32: Modelul structural al toxinei MT7 Modelul structural (Figura 32) al toxinei MT7 prezintă, prin urmare, o pliere cu trei degete, formată dintr-un miez hidrofob deținut de 4 punți disulfură și 3 bucle din aceasta. inima. Analiza geometriei acestei structuri (Figura 33) pe serverul RAMPAGE (Lovell, Davis și colab. 2003) demonstrează că toate reziduurile de proteine sunt situate în regiunile permise ale diagramei Ramachandran (Ramachandran, Ramakrishnan și colab. 1963), și că 63 de reziduuri se află în cele mai favorabile regiuni (favorizate). Prin urmare, acest model are proprietățile unei structuri de calitate cristalografică. 69

Capitolul 2: Studiul structural al partenerilor Figura 33: Diagrama Ramachandran a structurii toxinei MT7 Numărul de reziduuri din regiunile favorabile: 63 (98,4%) Numărul de reziduuri din regiunile autorizate: 2 (3,0%) Numărul de reziduuri din regiunile interzise: 0 (2,4%) 70

Capitolul 2: Studiul structural al partenerilor 71

Capitolul 3: Predicția structurii complexului hm1/mt7 Capitolul 3: Predicția structurii complexului hm1/mt7 72

Capitolul 3: Predicția structurii complexului hm1/mt7 3.1. Măsurătorile termodinamice hm1/mt7 Experimentele de mutageneză și măsurătorile termodinamice au fost efectuate de grupul lui Denis Servent (CEA SIMOPRO). 3.1.1. Model complex ternar Propus inițial pentru a descrie comportamentul unui RCPG care leagă atât ligandul său ortosteric, cât și o proteină G (De Lean, Stadel și colab. 1980), modelul complex ternar (TCM) poate fi de fapt generalizat la orice receptor care leagă simultan ligand ortosteric și alt ligand într-un al doilea site topografic diferit. În acest model, considerăm doar o singură stare de activare a receptorului la care se poate lega simultan un ligand ortosteric A și un ligand alosteric X cu afinități respective pentru receptorul liber KA și K X. Consecința legării unuia dintre liganzii la receptor trebuie să modifice cinetica de asociere și disociere a celuilalt ligand. Diferența de afinitate a ligandului ortosteric pentru receptorul liber sau legat de ligandul alosteric definește cooperativitatea sistemului notată α. Un factor α> 1, α d țintă: E contra = ½. K. (țintă d- d) ² Dacă d