Kefir: Producția de cereale și demonstrarea activității antimicrobiene

الجمهورية الجزائرية الديمقراطية الشعبية Algeriene Democratice si Populare وزارة التعليم العالي و البحث العلمي Ministerul Educației și frații Cercetare Științifică Universitatea Mentouri Constantin Facultatea de Științe ale Naturii și Vieții جامعة اإلخوة منتوري قسنطينة كلية علوم الطبيعة و الحياة قسم الميكروبيولوجيا Departamentul de Microbiologie dizertatie Prezentat în vederea până la obținerea masteratului Domeniu: Științe ale naturii și vieții Sector: Științe biologice Specialitate: Biotehnologie fungică/fermentare și producție de substanțe fungice Titlu: Kefir: Producția de cereale și identificarea activității antimicrobiene Prezentat și susținut de: BRIHMETTE Radja La: 06 iulie, 2017 CHAOUA Samah Juriul de apărare Președintele juriului: dna MIHOUBI I. Supervizor: dl KACEM CHAOUCHE N. Examinator: dna CHERFIA R. Tutor: dna BENHASSINE S. Prof. UFM Constantine. Prof. UFM Constantin. MAA.UFM Constantin. Dr. UFM.Constantin. Anul universitar 2016-2017

Dedicații Dedic această lucrare dragilor mei părinți, mamei mele iubitoare care nu a încetat niciodată să mă încurajeze și să se roage pentru mine, dragului meu tată care m-a învățat să am încredere în mine și care m-a împins mereu să merg mai departe. Dragilor mei frați care au fost, care sunt și care vor fi mereu acolo să mă sprijine. Pentru prietenele mele minunate Amira, Amina, Assia, Meriem și Radia. Colegilor mei Khadidja și Rokeya. Logodnicului meu și tuturor socrilor mei pentru încurajarea și afecțiunea lor. Samah

Cuprins 1-Introducere. 1 2- Revizuire bibliografică. 3 2.1- Informații generale despre boabele de chefir. 3 2.2- Originea și istoria kefirului. 3 2.3- Statistici privind consumul de chefir. 4 2.4- Structura boabelor de chefir. 5 2.5- Microflora boabelor de chefir. 6 2.5.1- Relațiile dintre microorganisme în chefir. 7 2.6- Formarea și producerea boabelor de chefir. 8 2.7- Calitatea boabelor de chefir. 9 2.8- Proceduri de fabricație. 9 2.8.1-Pregătirea dintr-o cultură mamă. 9 2.8.2- Pregătirea din chefir în sine. 10 2.8.3- Fabricarea industrială. 10 2.8.4- Conservare și întreținere. 10 2.8.5- Metoda de preparare a chefirului. 10 2.9- Compoziția Kefirului. 11 2.9.1- Lapte. 11 2.9.2- Acizi organici. 11 2.9.3- Lactoză. 12 2.10- Avantajele Kefirului. 12 2.11- Activitate antibacteriană. 13 2.11.1- Escherichia coli. 13

2.11.2- Bacillus subtilis. 14 2.11.3- Staphylococcus aureus. 14 2.11.4- Candida albicans. 14 2.11.5- Aspergillus flavus. 15 3-Materiale și metode. 16 3.1- Izolarea microflorei de Kefir și a boabelor de Kefir. 16 3.1.1- Originea și întreținerea bobului de kefir GK. 16 3.1.2- Izolarea microorganismelor din laptele fermentat. 17 3.1.3- Izolarea microorganismelor din boabele de Kefir „GK. 17 3.1.4- Izolarea microflorei Kefir a reprodus „GKS”. 18 3.1.5- Metoda de inoculare folosind lapte și boabe de chefir. 19 3.1.6- Purificarea tulpinilor. 20 3.2- Studiul activității antimicrobiene. 20 3.2.1- Reactivarea tulpinilor de testat. 20 3.2.2- Pregătirea probelor de zer. 21 3.2.3- Testul antagonismului. 21 3.2.3.1- Test de antagonism cu zer. 21 3.2.3.2- Test de antagonism folosind boabe de Kefir. 22 3.2.3.3- Test de antagonism folosind tulpini izolate din lapte fermentat și boabe de kefir. 22 4- Rezultate. 23 4.1- Izolarea microflorei de Kefir și a boabelor de Kefir. 23 4.2- Producerea boabelor de Kefir. 28 4.3- Studiul activității antimicrobiene. 28 4.3.1- Test de antagonism cu zer. 29

4.3.2- Test de antagonism folosind boabe de Kefir. 30 4.3.3- Test de antagonism folosind tulpini izolate din kefir și din boabele de kefir GK. 31 4.3.4- Test de antagonism folosind tulpini izolate din kefir și din boabele de kefir GKS. 33 5-Discuție. 35 6-Concluzie. 45 7-Rezumate. 47 9-referințe bibliografice. 49 10- Anexă

Lista abrevierilor APM: mediu peroxidant acetobacter BK: bulion de kefir ECEH: Escherichia coli enterohemoragică EPS: zaharidă exopolică GK: boabe de kefir GKS: boabe de kefir de sac LB: lactobacili LS: zer LSS: zer din sac MRS: Man agar, Rogosa, Sharpe PCA: număr de plăci agar HUS: sindrom hemolitic uremic SNLS: supernatant din zer SNLSS: supernatant din zer din STEC: Escherichia coli producătoare de toxine Shiga HIV: virusul imunodeficienței umane YPG: Drojdie, peptonă, glucoză

Lista tabelelor Tabelul 1: Condiții de cultură aplicate pentru izolarea și enumerarea grupelor microbiene din cereale. Tabelul 2: Tabel reprezentând câteva aspecte morfologice ale coloniilor dezvoltate pe mediul selectiv selectat, izolat din probe de lapte fermentat din boabe de Kefir. Tabelul 3: Tabelul care determină tulpinile izolate din diferitele probe. 26 Tabelul 4: rezultatul testului de antagonism al zerului pentru boabele GK și GKS, pe tulpinile de testare selectate. 29 Tabelul 5: rezultatul testului antagonismului granulelor GK și GKS, pe tulpinile de testare selectate. Tabelul 6: rezultatele testului de antagonism al tulpinilor izolate din Kefir și din boabele Kefir GK pe microorganismele testate. 32 Tabelul 7: rezultatele testului de antagonism al tulpinilor izolate din Kefir și din boabele Kefir GKS de pe microorganismele testate. 34

Lista figurilor Figura 1 prezintă structura boabelor de chefir. 5 Figura 2 Ilustrarea unui bob de kefir la mărire de 7000X. 17 Figura 3 Boabe de Kefir (GK). 16 Figura 4 Kefir fermentat. 16 Figura 5 Probele preparate din lapte fermentat. 17 Figura 6 Recuperarea boabelor de Kefir. 18 Figura 7 Boabe de Kefir dezinfectate. 18 Figura 8 Procesul de producție a cerealelor de Kefir. 18 Figura 9 Semănarea boabelor de Kefir GK. 19 Figura 10 Pregătirea probei de zer. 21 Figura 11 Recoltarea boabelor de Kefir produse de GKS. 28

Introducere în dezvoltarea de noi compuși antimicrobieni în afară de antibiotice, în acest caz probiotice. Prin urmare, căutarea activității antibacteriene și antifungice a semințelor de Kefir și Kefir a făcut ca obiectivul muncii noastre, pentru a face acest lucru, sunt vizate mai multe axe, și anume: izolarea grupurilor microbiene din semințele de Kefir și Kefir. Producția de semințe de Kefir în laborator. Demonstrarea activității antimicrobiene a Kefirului și originea acestuia. 2

Revizuire bibliografică sistemică și vorbim de candidemie. Candidemia se caracterizează printr-o mortalitate de aproximativ 40%. C. albicans poate genera, de asemenea, o multitudine de alte infecții, deoarece este un agent patogen oportunist foarte versatil: poate fi responsabil pentru infecția superficială a pielii, poate provoca erupție pe scutec la nou-născuți, bronhopneumonie și, sau pneumonie, vaginită, balanită sau poate fi responsabilă de infecții profunde (Dromer, 2013). 2.11.5- Aspergillus flavus o specie de ciupercă ascomicetă, cosmopolită, A. flavus poate coloniza multe substraturi (Abdul și colab., 1979). Aspergillus flavus este principalul producător de aflatoxine B1 (cea mai importantă), B2, G1 și G2 . Aflatoxina B1 este considerată în prezent cel mai important cancerigen natural cunoscut. Se produc alte micotoxine: acid pergilic, acid kojic (foarte toxic pentru animale), flavicină, flavicidină, granegilină, orizazină, acid flavicidic (fitotoxic), acid β-propionic, substanță remorgenică (Bennett, 2010). 15

Material si metode

Materiale și metode Apoi, s-au adăugat 1 g de boabe la 9 ml de apă fiziologică pentru a prepara o soluție (bulion de Kefir) „BK”; Tubul a fost agitat folosind un vortex. (Simova și colab., 2002) Semințarea a fost efectuată în același mod, explicat în secțiunea (3.2). Pe de altă parte, o cantitate de boabe a fost depozitată la -4 C în lapte praf pentru utilizare ulterioară. Figura 6 Recuperarea boabelor de Kefir Figura 7 Boabele de Kefir dezinfectate 3.1.4- Izolarea microflorei de Kefir reproduse „GKS” Prin urmarea celei mai tradiționale proceduri, s-a înființat o încercare de a produce boabe, prin introducerea bucăților de vițel abomasum ( 3%) (Beijerinck, 1889), spălat și clătit în apă distilată sterilă, într-o pungă de piele care conține 3 litri de lapte crud. Punga a fost apoi păstrată la temperatura camerei cu agitare din când în când și jumătate din cantitatea de lapte a fost reînnoită o singură dată între două fermentații de 72 de ore (Ot-es și Cagindi, 2003). Figura 8 Procesul de producție a cerealelor de Kefir 18

Materiale și metode După timpul de incubație, punga a fost scuturată bine, înainte ca o cantitate de lapte să fie turnată într-o cutie Petri sterilă și din care s-a diluat o doză de 1 ml într-un tub de 9 ml. Apă fiziologică, diluții zecimale de 10-1 până la 10-3 din suspensia inițială au fost apoi efectuate în același mod (Standardul NF ISO 7218). Aceeași procedură a fost repetată pentru o a doua cantitate de lapte turnată după o a doua agitare a pungii. 3.1.5- Metoda de inoculare din lapte și boabe de chefir Grupurile microbiene presupuse au fost izolate din lapte, precum și din bulionul de kefir "BK" prin împrăștiere, pe cutii Petri pe cultură mediană de agar selectiv (Anexa 1) și în condițiile de incubație. descris în Tabelul 2 (Ninane, 2008). Inocularea a fost efectuată fie la suprafață în condiții aerobe prin prelevarea a 0,1 ml din soluția testată, fie în masă prin prelevarea de 1 ml în condiții anaerobe (Bonnefoy și colab., 2002) . În ceea ce privește inocularea boabelor „GK” și „GKS”, aceasta a fost efectuată prin depunerea a câteva fragmente de boabe pe cutii Petri care conțin aceleași medii de cultură selective. Figura 9 Semănarea boabelor de Kefir GK 19

Rezultate Tabelul 2: Tabel reprezentând câteva aspecte morfologice ale coloniilor dezvoltate pe mediul selectiv selectat, izolat din probe de lapte fermentat din boabe de Kefir. Colonii medii dezvoltate Colonii medii dezvoltate MRS MRS + ATB Mayeux PCA APM MRS YGC „boabe dezinfectate” 25

Rezultate Tabelul 3: Tabel care determină tulpinile izolate din diferite probe N Cod Origine * Mediu * N Cod Origine * Mediu * N Cod Origine * Mediu * 1 L10-3 MS Lapte fermentat MRS 07 GS1 MS Boabe produse MRS 13 L3MY Lapte fermentat Mayeux de boabe GS de boabe GK. GK. 2 L 10-2 Lapte fermentat MRS 08 GS2 MS Boabe produse MRS 14 S10-3 MY Lapte din punga Mayeux MS de boabe GS GK. 3 S110-3 MS GS Lapte din sac MRS 09 GS1 ATB Boabe produse de MRS + ATB 15 S10-2 MY Lapte din sac Mayeux 4 S210-3 Lapte din sac MRS 10 GS2 ATB Boabe produse de MRS + ATB2 16 GKMY Boabe de Kefir Mayeux MS GS GK 5 S310-3 Lapte din sac MRS 11 L1MY Lapte fermentat de Mayeux 17 L1PC Lapte fermentat Boabe PCA MS GK de boabe GK. 6 boabe GK MS Kefir GK MRS 12 L 2MY Lapte fermentat cu boabe GK. Mayeux 18 S110-3 PC Lapte din punga PCA 26

Rezultate N Cod Origine * Mediu * N Cod Origine * Mediu * N Cod Origine * Mediu * 19 S2 PC Lapte din sac PCA 24 BKPM Bulion din APM 28 S2 (10-3) YG Lapte din sac YGC Boabe de Kefir BK 20 L110 - 2 PM lapte fermentat cereale APM 25 L1 YG GK lapte fermentat cereale 21 L2PM APM fermentat cereale 26 L2YG lapte fermentat cereale GK. YGC 29 BK1YG Bulion din boabe de Kefir YGC 30 BK2YG Bulion din boabe de Kefir YKC BK 22 S10-3 PM Lapte din sac APM 27 S110-3 YG Lapte din sac YGC 31 L2 PC Lapte fermentat PCA de boabe GK 23 S10 -1 PM Lapte din punga APM Medium *: mediu de izolare. Origine *: eșantion inoculat 27