Utilizarea sinergică a celulelor neuronale precursoare și a peptidelor de auto-asamblare în leziunile experimentale ale măduvei spinării cervicale

Abstract

Introducere

Peste 50% din leziunile măduvei spinării sunt legate de coloana cervicală. În practica clinică, sunt descrise două mecanisme fiziopatologice principale: prima contuzie a măduvei spinării și apoi compresia permanentă cauzată de fracturi osoase, hemoragii sau umflarea țesuturilor.

Modelul de contuzie mimetic/de compresie al clipului de anevrism două mecanisme fiziopatologice: fixarea clipului produce contuzie și durata tăieturii corespunde componentei compresiei, presupunând că compresia în setările clinice cauzată de fracturi osoase, hemoragii sau umflături ale țesuturilor ultima etapă terminată. Clema de anevrism utilizată este modificată de un arc inelar asigurând o forță de ciupire exactă și reproductibilă. Mai ales în comparație cu modelul de semitransecție sau contuzie, acest model de clip de anevrism imită parametri clinici mai buni. Deși pacienții cu leziuni toracice suferă de paraplegie, majoritatea pacienților cu infecție a tractului urinar cervical sunt tetraplegici și complet dependenți. Cu toate acestea, structura anatomică a cordonului cervical prezintă diferențe semnificative în comparație cu cea toracică sau lombară și, prin urmare, este abordată în mod special în acest protocol.

Dezvoltarea cavităților medulare și a cicatricilor țesuturilor sunt obstacole în calea recuperării și regenerării. Depășirea acestor obstacole cu utilizarea echipamentelor de schele este o abordare promițătoare. Peptidele auto-asamblabile pot fi injectate direct în epicentrul leziunii. Acolo, acestea se asamblează în schele din nano-fibre pentru a tranziția cavității și pentru a îmbunătăți mediul înconjurător prin reducerea inflamației inhibitoare și speria țesutului. Deși materialele rigide cauzează leziuni considerabile ale măduvei spinării în timpul implantării, peptidele pot fi injectate în condiții de siguranță și fără alte daune grave.

Îmbunătățirea mediului inhibitor cu peptide de auto-asamblare înainte de transplantul de celule stem, prin urmare, susține INTEGRAREA celulară, diferențierea și, în cele din urmă, recuperarea funcțională după leziunea măduvei spinării cervicale.

Abonament necesar. Vă rugăm să recomandați JoVE bibliotecarului dvs.

Protocol

NOTĂ: Următorul protocol experimental a fost aprobat de Comitetul de îngrijire a animalelor din Rețeaua de sănătate a universității (Toronto, Canada) și este conform cu politicile stabilite în Ghidul pentru îngrijirea și utilizarea animalelor de laborator pregătit de Consiliul canadian pentru îngrijirea animalelor .

1. Model de contuzie/compresie a clipului de anevrism cervical

2. Injecție PAS și PNJ (14 zile după vătămare)

90% celule vii în suspensia celulară. Diluați celulele în mediu de creștere (50 x 103 celule vii/µl), apoi folosiți-le pentru transplantul de celule.

  • Efectuați patru injecții intraspinale de 2 µl (8 µl vo, conținând 4 x 105 NPC-uri) bilateral la 2 mm rostral și caudal de la locul leziunii. După deschiderea durei, introduceți microcapilarul din sticlă Hamilton la 1,5 mm sub suprafața dorsală a măduvei spinării și injectați 2 µl din suspensia celulară. Alegeți o rată de injecție de aproximativ 0,5 l/min (min).
  • La sfârșitul fiecărei injecții și înainte de a scoate capilarul din cordon, așteptați cel puțin un minut pentru întinderea țesutului pentru a se potrivi noul volum al celulei. (Figura 2)

    • 3. Implantarea pompelor subdurale pentru aplicarea factorului de creștere

    4. evaluarea țesutului

    1. Sacrificați animalele la sfârșitul perioadei de observație (de exemplu, 4 săptămâni după SCI) în anestezie profundă (5% izofluran timp de 2-3 minute) și perfuzați transcardiacii cu 50 ml rece (4 ° C) urmat de soluție salină rece 150 ml 4% paraformaldehidă în soluție salină tamponată cu fosfat 0,1 M (PBS).
    2. Îndepărtați măduva spinării și puneți-o în paraformaldehidă 4% în soluție salină tamponată cu fosfat 0,1 M (PBS) timp de 24 de ore.
    3. Puneți măduva spinării într-o soluție de zaharoză 25% pentru crioprotecție timp de 48 de ore.
    4. Furnizați criosecțiuni longitudinale cu o grosime de abonament necesar. Vă rugăm să recomandați JoVE bibliotecarului dvs.

    Rezultate reprezentative

    Când efectuați procedura descrisă mai sus, veți obține o schelă SAP care umple cavitatea și oferă un mediu inhibitor îmbunătățit, mai puțină sperietură a țesuturilor și o supraviețuire crescută a AFN. Figura 4 prezintă o secțiune longitudinală a măduvei spinării de șobolan obținută la locul leziunii la șase săptămâni după SCI și la patru săptămâni după injectarea NQ6 SAP și transplantul PNJ. Peptidele NQ6 au fost injectate cu succes în cordon, agregate la epicentru și difuzate rostro-caudal în penumbra. Microscopul electronic imagistic arată în plus, pe figura 5, setați 1% (g/v) peptide NQ6 la o schelă nanofibră în două ore diluate în soluții de PBS.

    Această matrice oferă un mediu inhibitor îmbunătățit care contribuie la creșterea supraviețuirii celulare și diferențierea celulară, cicatrizarea țesutului inferior și duce la o șansă mai bună de recuperare funcțională în cele din urmă.

    ure 1 "src ="/files/ftp_upload/52105/52105fig1highres.jpg "/>
    Figura 1: Anevrism de contuzie/compresie a modelului de clip (A) fotografie prin microscop chirurgical după laminectomie C7/T1 și contuzie/comprimare a măduvei spinării unui șobolan (B) Imaginea clemei cu arcul inelar asigurând precis. forta de inchidere.

    utilizarea

    Figura 2: Puncte de injectare PAS și celule stem puncte ilustrație grafică injecţie:. 2 injecții stereotaxice efectuate cu SAP în epicentrul leziunii, urmate de patru injecții de NPC în coloanele dorsale adiacente cu o distanță de 2 mm caudală și rostrală de la epicentru.


    Figura 3: Cateter subdural pentru eliberarea factorului de creștere din fotografie prin microscopul chirurgical: (LA) Cateter subdural implantat în vederea administrării factorilor de creștere:. cateterul este asigurat de mai multe suturi la mușchii coloanei vertebrale 6.0; deschidere mică a durei la C5; poziționarea cateterului subdural cu capătul deschis al cateterului aproape de locul leziunii la C7/T1. (B) de cateter conectat la o micro pompă plasată într-o adâncitură subdurală pe flancul lateral.


    Figura 4: Livrarea cu succes a programelor de ajustare structurală și a NPC-urilor în măduva spinării cervicală pata fluorescentă (fundal DAPI, albastru) a unei secțiuni longitudinale a măduvei spinării a unui șobolan traumatizat. NU sunt marcate (NQ6-FITC, verde) s-au agregat în epicentrul leziunii. NPC-urile injectate (DsRed pozitiv, roșu) difuzate în direcții rostrală și caudală. Bara de măsurare se referă la 5 mm.


    Figura 5:. Instruirea schelelor de nanofibre Imagine a microscopului electronic cu scanare (SEM) care arată formarea nanofibrelor de schele ale PAS-ului asamblat. Bara de scalare se referă la 1 um).

    Abonament necesar. Vă rugăm să recomandați JoVE bibliotecarului dvs.

    Discuţie

    Acest protocol a fost dezvoltat pentru a permite cititorului să efectueze un model de leziune cervicală la șobolani și să utilizeze o abordare de tratament combinată cu PAS și NPC-uri care promovează o recuperare mai bună după SCI cervicală.

    Mai ales în comparație cu alte modele de traume cervicale, cum ar fi modelul (hemi) -transecție sau modelele de scădere în greutate și comotie, modelul de contuzie clip/compresie reprezintă atât principalele mecanisme ale traumei fiziopatologice - contuzie și compresie și, prin urmare, imită o mai bună clinică condiții. Deși este bine stabilit pentru utilizarea în coloana toracică șobolan și șoarece 7-11, a fost recent adaptat pentru utilizare în coloana cervicală. Aceasta a fost o piatră de hotar, deoarece leziunile coloanei vertebrale cervicale sunt cele mai frecvent observate în clinică, iar anatomia colului uterin variază foarte mult de la coloana toracică. În plus, pacienții cu tetrapareză cervicală IBS sunt dornici să-și recapete funcția motorie cel puțin parțială a extremităților superioare.

    Peptidele auto-asamblate au fost identificate având potențial de a umple cavitatea și de a îmbunătăți și mai mult mediul inhibitor la locul leziunii, ducând în cele din urmă chiar la regenerarea și germinarea axonală 5,12,13,14. QL-șase nanofibre se asamblează pentru a schela ocoli cavitatea intramedulară și, prin urmare, pot oferi o matrice pentru înmugurirea și regenerarea axonală și pot îmbunătăți mediul inhibitor înainte de transplantul de celule. Avantajele acestor peptide constau în vâscozitatea lor scăzută (fluid) și pH-ul neutru. Mai ales în comparație cu hidrogelurile sau schelele cu țesut vâscos, PAS poate fi ușor injectat în măduva spinării rănită și leziunile ulterioare cauzate de injecția în sine sunt limitate.

    Deși nanofibrele NQ6 în sine ar putea îmbunătăți supraviețuirea celulelor 4,15, totuși, utilizarea factorilor de creștere pare să fie de beneficiu 16,17,18,19,20,21. Ele pot fi administrate fie prin eliberarea factorilor de creștere din hidrogeluri 22, fie prin aplicare prin pompe osmotice (așa cum este descris mai sus). Pompele osmotice legate de catetere subdurale oferă avantajul eliberării continue și controlate și, prin urmare, îmbogățirea lichidului cervical cervical (LCR). Cu toate acestea, plasarea cateterului subdural este dificilă mai ales în comparație cu cicatricile mari care ar fi putut să apară după câteva săptămâni după leziune.

    Pentru a asigura condiții tisulare bune pentru supraviețuirea și integrarea APN, mai multe studii au ales locurile de injectare în substanța albă adiacentă, 2 mm rostral sau caudal către locul leziunii și nu direct către epicentrul leziunii 4, 15,18. Acolo, NPC-urile au șanse mai mari de supraviețuire, integrare și diferențiere în astrocite, oligodendrocite sau neuroni și pot migra către sau în leziunea rezultată din înmugurirea axonală și conectivitatea axonală îmbunătățită.

    După însușirea acestor tehnici, acest protocol de potențialitate propus fie adoptat de utilizatori individuali în funcție de nevoile și interesele lor, cuprinzând modificări ale nivelului și severității leziunii, utilizarea diferitelor tipuri de celule sau a factorilor de creștere sau adăugarea de „alte substanțe neuro-protectoare .

    Pe scurt, tratamentul combinat cu PAS și NPC-uri ar putea oferi o nouă abordare promițătoare și să depășească cele mai dificile obstacole în tratamentul SCI: cavități și cicatrici tisulare.

    Abonament necesar. Vă rugăm să recomandați JoVE bibliotecarului dvs.

    Mulțumiri

    Dorim să recunoaștem sprijinul finanțat pentru această lucrare de către Institutele Canadiene de Cercetare în Sănătate (CIHR), Fundația Familiei Krembil, Președintele Halbert în Reparații și Regenerare Neurală, Phillip și Peggy DeZwirek și Gordon Yao pentru contribuția din figura 2. Klaus Zweckberger a fost finanțat printr-un grant de la „Deutsche Forschungsgesellschaft” (DFG).